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Understanding polyoma DNA (Part 2)

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Understanding polyoma DNA (Part 1)
Renato Dulbecco Scientist
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Adesso ritornando a quello di cui avevo cominciato a parlare prima, cioè questo- il virus del polioma e dicevo che il suo genoma era fatto di DNA e che perciò era adatto per me, per fare tutto il lavoro che si riferiva a capire come questo DNA funziona. E una delle cose che ho fatto immediatamente è quello di- non so se l'ho fatto veramente come un compito specifico oppure è venuto fuori facendo un lavoro col virus, col DNA del virus- che ho visto che questo DNA del virus era presente in due forme e questo si vede specialmente- per isolare il DNA, quello che si fa generalmente è si mette questo virus che ha DNA dentro e proteina fuori, si mette in una sostanza che- una specie di sapone- che rompe la proteina in maniera che separa le proteine e il DNA, e poi il tutto si mette in un tubo di centrifuga, dove c'è un gradiente più denso al fondo, meno denso alla superficie, oppure semplicemente un gradiente per mantenere la localizzazione- quello è lo scopo, perché si vuol far sedimentare questo DNA nella provetta, ma bisogna esser certi che- mentre sedimenta, rimanga dov'era poi, perché altrimenti non si tira fuori il tubo, non ci sarebbe più. Facendo quello, generalmente, con un virus così, generalmente c'è una sola banda di questo DNA del virus, invece lì ce n'erano due e questo mi ha stupito. Poi mi sono visto, guardando la letteratura, che si era fatta un'osservazione simile con il virus del papilloma, che è anche DNA, ed era stata interpretata questa col fatto che c'erano particelle del virus che avevano una lunghezza del DNA e altre che ne avevano due lunghezze, perciò quelle che avevano una lunghezza andavano più in fretta, no anzi al contrario, quelle che avevano due lunghezze andavano più in fretta e quelle che ne avevano una rimanevano più indietro. Allora, per risolvere questo problema, abbiamo fatto quello che si chiama una colonna. Una colonna vuol dire insomma- prendiamo un tubo di vetro in cui si mette una sostanza a cui il DNA tende ad attaccarsi, ma non permanentemente, per cui se si fa andare giù questo DNA attraverso questa colonna, ogni tanto si attacca e perciò rallenta e poi si attacca di nuovo e poi rallenta, per cui se è più lungo, ha più possibilità di attaccarsi, se è più corto, ha meno possibilità. Perciò, se fosse di lunghezza doppia uno, rimarrebbe più verso la cima, sarebbe rallentato più di quello che non sia quello che ha la lunghezza semplice. L'abbiamo fatto questo con il DNA del polioma e si è visto, invece che venivano insieme, dunque, perciò, non è questione di lunghezza, è questione di struttura e lì allora- Qual' è la struttura?. E c'erano due possibilità: questo di usare vedere e di usare l'effetto di un enzima che taglia il DNA e l'altra era di fare, di osservare queste molecole del DNA al microscopio elettronico, perché al microscopio normale non si vedono, sono troppo piccole, ma al microscopio elettronico si vedono bene. Ho cominciato con gli enzimi, con la DNAsi, come si chiama l'enzima che taglia il DNA e, usandola a dosi molto piccole, si può ottenere un solo taglio per molecola e quando ho fatto questo, vedevo che la molecola che era la più veloce rallentava, perciò il taglio causava un rallentamento e lì una possibilità che sembrava facile era che la DNAsi tagliava questa molecola in modo che- non la tagliava in due pezzi, ma rimaneva sempre un pezzo, perché era circolare. Col taglio di un circolo, si ottiene una molecola lineare più lunga e allora questa molecola più lunga- non più lunga, la stessa lunghezza, ma di forma diversa pensavo sarebbe rallentata, appunto data la forma. E allora la cosa importante era fare il controllo al microscopio elettronico; putroppo non ci sono riuscito, una cosa stranissima. Lì al Caltech, noi non l'avevamo il microscopio elettronico, l'avevano in Chimica e bisognava perciò mettersi d'accordo con loro e ho provato un mucchio di volte a farlo- non so, credo che fosse qualche problema con la persona in carica; alla fine, non ce l'ho fatta più e ho pubblicato i lavori dicendo che c'erano due forme, una rotonda e una non rotonda, lineare. In fondo, poi è risultato che non era vero e la forma che io- sì, era circolare, ma erano due forme circolari, una circolare che- bisogna capire questo che, quando si forma questo anello del DNA durante la replicazione del virus, si forma assieme a molte proteine che lo proteggono, per cui la forma dell'anello che si forma, non è solo la forma del DNA, ma la forma del DNA più proteine. Quando lo purifichiamo, il DNA che è normalmente a contatto con le proteine, e le proteine adesso non ci sono più, rimane sempre a forma nucleare, però non ha più- insomma si mantiene la forma ad elica- non rimane a elica liscia, come dovrebbe essere, invece si aggroviglia, allora si forma questo aggrovigliamento. È per questo che la forma veloce era la forma aggrovigliata. Se si taglia con la DNAsi, che generalmente taglia solo uno dei filamenti del DNA, l'aggrovigliamento si scioglie. E allora, perciò, la differenza era tra la forma aggrovigliata e una forma non aggrovigliata, però sempre il fatto che era una forma circolare, quella rimaneva lì.
So, coming back to what I started to talk about before, that is, the polyoma virus and I was saying that its genome was made of DNA and that therefore it was right for me, in order to carry out all the work that was needed to understand how this DNA worked. And one of the things that I did straight away was to- I don't know if I really did it as a specific task or whether it came about while I was working with the virus, with viral DNA- that I saw that this viral DNA was present in two forms and this could be seen particularly- to isolate the DNA, what is generally done is to put this virus that has DNA in it and protein outside, to put it in a substance that- a type of soap- that breaks the protein in such a way as to separate the proteins and the DNA, and then everything is placed in a centrifugal tube, where there is a thicker gradient at the bottom, less dense on the surface, or simply a gradient to maintain localisation- this is the aim, because this DNA needs to be sedimented in the test-tube, but you need to be certain that- while it sedimentates, it remains where it is, then, because otherwise you cannot take it out of the tube, it would no longer be there. Doing this, generally, with this type of virus there is only a single band of this viral DNA, however here there were two and this amazed me. Then I saw, looking at the literature, that a similar observation had been made with the papyloma virus, which is also DNA, and this was interpreted by the fact that there were virus particles which had one DNA length and others that had two lengths, therefore those which had one length moved more quickly, no actually it's the other way round, those that had two lengths moved more quickly and those that had one stayed behind more. So, to resolve this problem, we carried out what we call a column. A column means- you take a glass tube into which you put a substance which DNA tends to attack, but not permanently, so that if it makes this DNA go down through this column, every so often it attacks and so slows and then it attacks again and then slows down, so that if it is longer it has more possibility of attacking, if it is shorter, there is less possibility. Therefore, if one is of double length, it would stay more at the top, it would be more slowed down than the one with the single length. We did this with the polyoma DNA and we saw, instead that they came together, so, therefore, it is not a question of length, it's a question of structure and then- What is the structure? There are two possibilities: that of using to see and using the effect of an enzyme that cuts the DNA and the other was to observe these DNA molecules under an electronic microscope, because under a normal microscope you can't see, they are too small, but under an electronic microscope you can see properly. I started with enzymes, with Dnase, as the enzyme that cuts DNA is called and, using this in very small doses, you could obtain a single cut per molecule and when I did this, I saw that the molecule that was the quickest, slowed down, so the cut caused a slowing down and there a possibility that seemed easy was that the Dnase was cutting this molecule in a way that- it was not cutting it into two pieces, but it always stayed in one piece, because it was circular. With the cut of a circle, a longer linear molecule was obtained and then this longer molecule- not longer, the same length, but a different shape I thought would have slowed down, given its shape. Then the important thing was to carry out the test under the electronic microscope; however this didn't work, very strange indeed. There in Caltech, we didn't have an electronic microscope, they had one in the Chemistry department and I needed to check it with them and I tried loads of times to do this- I don't know, I think that there was some problem or other with the person in charge. Finally, I gave up and I published works saying that there were two shapes, one round and one not round, linear. Afterwards it emerged that this wasn't true and the shape that I- yes, was circular, but there were two circular shapes, a circular shape that- it is necessary to understand this that, when this DNA ring is formed during the replication of the virus, it is formed together with many proteins that protect it, so that the ring shape that is formed, is not only the DNA shape, but the DNA shape plus proteins. When we purify them, the DNA that is usually in contact with the proteins, and the proteins are no longer there, always remain in nuclear form, therefore it no longer- in short, it keeps its helix shape- it does not remain a smooth helix, as it should be, instead it becomes entangled, then it forms this entanglement. This is why the fast form was the entangled form. If it cuts with the Dnase, which generally only cuts one of the DNA strands, the entanglement comes undone. And then, therefore, the difference was between the entangled form and an un-entangled form, so always the fact that it was a circular shape, this remained there.

The Italian biologist Renato Dulbecco (1914-2012) had early success isolating a mutant of the polio virus which was used to create a life-saving vaccine. Later in his career, he initiated the Human Genome Project and was jointly awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1975 for furthering our understanding of cancer caused by viruses.

Listeners: Paola De Paoli Marchetti

Paola De Paoli Marchetti is a science journalist who graduated with an honours degree in foreign languages and literature from the University Ca’Foscari, Venice. She has been a science journalist since the 1960s and has been on the staff of the newspaper Il Sole 24 Ore since 1970. She was elected president of UGIS (Italian Association of Science Journalists) in 1984. She has been a Member of the Board of EUSJA (European Union of Science Journalists’ Associations, Strasbourg), and was its president in 1987-1988 and 1998-2000. In May 2000 she was unanimously elected president emeritus. She was a member of the National Council of Italian Journalists (1992-1998). From 2002 to 2004 she was member of the working group for scientific communication of the National Committee for Biotechnology. She has also been a consultant at the Italian Ministry of Research and Technology and editor-in-chief of the publication MRST, policy of science and technology. She has co-authored many publications in the field of scientific information, including Le biotecnologie in Italia, Le piste della ricerca and Luna vent’anni dopo.

Duration: 7 minutes, 21 seconds

Date story recorded: May 2005

Date story went live: 24 January 2008