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Innovation at Cold Spring Harbor

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Understanding polyoma DNA (Part 2)
Renato Dulbecco Scientist
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This issue about DNA shape, led to, was symbolic, because we were already thinking, we already suspected that viral DNA remained within the cells and, for example, it was known that these cells transformed by the virus, a substance appears, an antigen that is recognised with special antibodies and does not exist in normal cells; therefore, the origin of this antigen is not clear, but it was a sign that perhaps there were viral genes that were active. And the question that it was circular was very useful, it was another sign, because, if we take a circular molecule and a linear molecule that fit together and then there is an exchange between the two, the circular molecule inserts into the linear molecule- Isn't it the other way round? No, no, it inserts, precisely, because it is round, thus this opens, there are two pieces. And this is why it was another sign that the viral DNA was truly incorporated into the cellular DNA. Therefore, at this particular point, there were a large number of signs and the question was to try and see how it was possible to show, if this was true, that the DNA was in the cell and was incorporated. At this point, things were going very well for me because, this work that I had already carried out, had attracted a significant number of young researchers, who came to work in my group and many of these researchers came from other groups, where they had also learned new technologies and, you know, new technologies are fundamental to research- so we started with these young researchers, targeting this problem and everyone made their contribution and now I can explain what happened. For example, at the start, the first thing that we wanted to know was this: if we take a cell transformed by the polyoma virus, will the viral DNA remain in the cell? Question. This was the question. And the question- a way of answering the question then emerged. There was the technique, as it is called, of the hybridisation of DNA and RNA molecules, which means that if I have two molecules that are of the same type, equal and I release them- because the two strands both separate- and then I join them together, then they form two molecules that are a mix of the two. This is hybridisation. And this can be done easily and shows- and is- therefore- a young man came, he was German, who came from another laboratory where they were routinely performing this hybridisation, so that he had done this- so we said, is there viral DNA there? He carried out the experiment- yes, there was. Therefore, the viral DNA that was present in the cells. Point 1. Then point 2: is the DNA that is present integrated into the chromosome of the cells or is it separate? Why did both possibilities exist. And in order to do this, we had to organise a system whereby we could isolate the viral DNA from the cellular DNA in the same tube- and now the question of size. The cellular DNA needed to be isolated in such a way that it is very large and this started from the start with difficulty, because with many of the techniques used at this time, when the DNA is extracted, the DNA is broken into pieces, so that it would be impossible to distinguish one from the other. But speaking with a colleague who worked with DNA, he showed that that they were using a special technique, whereby the DNA from the cells were not isolated with the normal method, but they took- they formed one of these gradients that I was talking about earlier, they put the cells at the top of the gradient, not the DNA, but all the intact cells, that were mixed with the substance that lysed them and then this allowed the DNA to be released, but they were all placed at the top, so that there was no alteration movement, no movement to alter the DNA. And then the entire tube was put into the centrifuge, in such a way that there was a gradual reduction, and the cellular DNA, which remained almost intact, not perfectly, but almost intact, went down to the bottom, while the viral DNA instead remained a little higher. And this allowed us to see, above all to distinguish the cellular DNA from the viral DNA and thus allowed us to see if the viral DNA was integrated by taking, on the one part, cells not transformed and mixed with the viral DNA and, on the other, transformed cells, where the viral DNA is already there. And doing both, it could be clearly seen that, while in the control, both the viral DNA and the other separated, in the other they did not separate at all, which proved that the cellular DNA was incorporated- that the viral DNA was incorporated into the cellular DNA. This explained everything because if the cellular DNA was in the viral DNA, the cellular DNA genes were certainly working- then we have proven this, but already there was an important point, because if the DNA is there, if there are genes, the genes respond to all the cell systems and therefore should be expressed. Therefore this was the starting point for truly understanding what this viral transformation was.
Questa questione della forma del DNA, aveva portato, aveva significato come indizio, vedi, perché già si pensava, già si avevano dei sospetti che il DNA del virus rimanesse dentro le cellule e, per esempio, si sapeva che queste cellule trasformate dal virus, compare una sostanza, un antigene che si riconosce con degli anticorpi speciali e non esiste nelle cellule normali; dunque, perciò, l'origine di questo antigene non era chiaro, ma era un indizio che forse c'erano dei geni del virus che erano attivi. E la questione che fosse circolare era molto utile, era un altro indizio, perché, se prendiamo una molecola circolare e una molecola lineare che si mettono insieme e poi c'è uno scambio tra le due, la molecola circolare si inserisce nella molecola lineare- Non è il contrario? No, no, si inserisce, appunto, perché è rotonda, così questo si apre, hanno due pezzi. E questo perciò era un altro indizio che il DNA del virus fosse incorporato veramente nel DNA cellulare. Perciò, a quel punto lì, c'erano tutto questo gran numero di indizi e la questione era cercare di vedere come si poteva dimostrare, se era vero questo, che il DNA era nella cellula ed era incorporato. A questo punto, le cose sono andate molto bene per me perché, quel lavoro che avevo già fatto, aveva attratto un notevole numero di giovani ricercatori, che venivano a lavorare nel mio gruppo e molti di questi ricercatori provenivano da altri gruppi, dove avevano imparato anche delle tecnologie nuove e, sai, le tecnologie nuove sono fondamentali nella ricerca- per cui abbiamo cominciato con questi giovani ricercatori, appunto, mirando a questo problema e ciasceduno ha fatto il suo contributo e adesso posso spiegare come è successo. Per esempio, al principio, la prima cosa che si voleva sapere è questa: se prendiamo una cellula trasformata dal virus del polioma, il DNA del virus persiste nella cellula? Domanda. Questa era la domanda. E la domanda- allora è venuto fuori un modo per rispondere alla domanda. C'era la tecnica, come viene chiamata, dell'ibridizzazione delle molecule del DNA, dell'RNA, il che significa che se io ho due molecole che sono dello stesso tipo, uguali e le faccio sciogliere- perché i due filamenti si separano tutti e due- e poi li faccio riunire, allora formano due molecole che sono una miscela delle due. Questa è l'ibridizzazione. E questo si può fare facilmente e dimostra insomma- ed è- perciò- era venuto un giovane, era un tedesco, che veniva da un altro laboratorio dove facevano questa ibridizzazione come routine, diciamo, per cui lui l'aveva fatta- per cui abbiam detto, c'è il DNA del virus lì? Lui ha fatto l'esperimento- sì, c'era. Perciò, il DNA del virus era presente nelle cellule. Punto 1. Poi, punto 2: il DNA che è presente è integrato nel cromosoma delle cellule oppure è separato? perché tutte e due le possibilità esistevano. E per fare questo, abbiamo dovuto organizzare un sistema per cui si potesse isolare il DNA virale dal DNA cellulare nello stesso tubo- e ora è questione di grandezza. Il DNA cellulare bisognava isolarlo in maniera che fosse molto grande e questo cominciava dal principio con difficoltà, perché con molte delle tecniche usate in quel tempo, quando si estraeva il DNA, il DNA veniva rotto in pezzi, per cui sarebbe stato impossibile distinguere l'uno dall'altro. Ma parlando con un collega che lavorava con il DNA, questo mi ha fatto vedere che loro usavano una tecnica speciale, per cui non isolavano il DNA dalle cellule col metodo normale, ma prendevano- formavano uno di questi gradienti di cui parlavo prima, alla cima del gradiente mettevano le cellule, non il DNA, ma tutte le cellule intatte, che erano mescolate con la sostanza che le faceva lisare e perciò permetteva poi al DNA di essere libero, ma erano tutte messe in cima, per cui non c'era nessun movimento alterazione, nessuna movimento per alterare il DNA. E poi si faceva, poi tutto il tubo si metteva nella centrifuga, in maniera che c'era progressiva diminuzione, e il DNA cellulare, che rimaneva quasi intatto, non perfettamente, ma quasi intatto, andava giù al fondo, mentre invece il DNA virale rimaneva un po' più alto. E questo permetteva perciò di vedere, prima di tutto di distinguere il DNA cellulare dal DNA virale e perciò permetteva di andare a vedere se il DNA virale era integrato prendendo, da una parte, cellule non trasformate e mescolate col DNA del virus e, dall'altra, le cellule trasformate, dove il DNA del virus era già lì. E facendo le due, si è visto chiaramente che, mentre nel controllo, i due, il DNA virale e l'altro, si separavano, nell'altro non si separavano affatto, il che era prova che il DNA cellulare era incorporato- che il DNA virale era incorporato nel DNA cellulare. Questo spiegava tutto, perché se allora se il DNA cellulare era nel DNA virale, i geni del DNA cellulare certamente funzionavano- poi l'abbiamo provato questo, ma già lì era un punto importante, perché se il DNA è lì, se ci sono i geni, i geni rispondono a tutti i sistemi della cellula e perciò dovrebbero essere espressi. Perciò questo era il punto di partenza per veramente capire che cos'è questa trasformazione virale.

The Italian biologist Renato Dulbecco (1914-2012) had early success isolating a mutant of the polio virus which was used to create a life-saving vaccine. Later in his career, he initiated the Human Genome Project and was jointly awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1975 for furthering our understanding of cancer caused by viruses.

Listeners: Paola De Paoli Marchetti

Paola De Paoli Marchetti is a science journalist who graduated with an honours degree in foreign languages and literature from the University Ca’Foscari, Venice. She has been a science journalist since the 1960s and has been on the staff of the newspaper Il Sole 24 Ore since 1970. She was elected president of UGIS (Italian Association of Science Journalists) in 1984. She has been a Member of the Board of EUSJA (European Union of Science Journalists’ Associations, Strasbourg), and was its president in 1987-1988 and 1998-2000. In May 2000 she was unanimously elected president emeritus. She was a member of the National Council of Italian Journalists (1992-1998). From 2002 to 2004 she was member of the working group for scientific communication of the National Committee for Biotechnology. She has also been a consultant at the Italian Ministry of Research and Technology and editor-in-chief of the publication MRST, policy of science and technology. She has co-authored many publications in the field of scientific information, including Le biotecnologie in Italia, Le piste della ricerca and Luna vent’anni dopo.

Duration: 7 minutes, 6 seconds

Date story recorded: May 2005

Date story went live: 24 January 2008